琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis）是一种常用于分离、鉴定和提纯 DNA 片段的电泳技术。它以琼脂或琼脂糖为介质，借助电场驱动 DNA 分子在凝胶内移动，从而实现不同大小分子的分离。琼脂糖凝胶电泳与其他支持物电泳的主要区别在于，它兼具 “分子筛” 和 “电泳” 的双重作用。
水平电泳仪
原理
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为介质，对不同大小的 DNA 或 RNA 进行分离的电泳方法。琼脂糖是一种多糖，具有亲水性且不带电荷。核酸分子属于两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（如 pH8.0 的缓冲液）中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，使得核酸分子带负电荷。在电流作用下，以琼脂糖凝胶为介质，核酸分子从负极向正极移动。由于不同的 DNA 分子片段在大小和形状上存在差异，它们在电场中的泳动速率各不相同。同时，在样品中加入染料（如 EB 或花青素类染料），染料能够和 DNA 分子形成络合物，经过紫外照射后，可以观察到 DNA 的位置（通过与 marker 比对可知分子量大小），进而达到分离、鉴定的目的。
DNA 凝胶电泳的步骤
仪器耗材
核酸电泳仪、电泳槽、暗箱紫外投射仪、梳子、微波炉、三角瓶、试剂瓶、移液枪、枪头。
电泳缓冲液
50xTAE 配方（1L 用量）：
Tris：242g
冰醋酸：57.1mL
EDTA(0.5mol/L)(pH8.0)：100mL
8L1XTAE 配置：
取 160 mL50XTAE，加入 ddH₂O 至 8L，充分混匀后使用。
胶浓度选择
电泳
100 mL 的 1% 琼脂糖凝胶电泳液的配制：
称取 1g 琼脂糖置于干净的三角瓶中，加入 100 mL1XTAE 电泳缓冲液（注意液体不得超过三角瓶容积的三分之一，以免沸腾后溢出），轻轻晃动使其混合均匀后，放入微波炉（中高火）加热。在沸腾间隙拿出缓慢水平摇晃，这样既能加快琼脂糖溶化，又能避免水分过量蒸发（操作时小心烫手）。待琼脂糖颗粒全部溶解后，取出晾凉至 55℃备用（注意防止烫伤）。可根据所需的胶浓度计算并称取相应质量的琼脂糖。
加样准备：
加 10μL（1:10000，染料已稀释 2 倍）GelRed 于制胶模上，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，用玻璃棒将其混合均匀。在适当位置插入梳齿（产物上样量：小梳齿 3 - 10 μL，中梳齿 10 - 30μL，大梳齿 30 - 50μL），于室温下凝固（大约 30 min）。
上样电泳：
待胶凝好后，垂直向上拔出梳齿，然后将胶放入电泳槽内，使样品孔靠近阴极端（黑色电极）。加入 1XTAE 电泳缓冲液至液面刚好覆盖凝胶。将 DNA 样品用移液器小心加入点样孔，每加一个样品要及时更换枪头。注意：在载体构建中菌 P 时，枪头每次上样后可在电泳液中吸打两次后继续点样；其余样品上样时需更换枪头。加样后，合上电泳槽盖，确认阴阳极电源线连接正确（黑对黑，红对红），打开电泳仪开关，以恒定电压模式开始电泳。电压一般设为 130V，定时 20min，当指示剂带移近胶前沿（1 - 2cm）时停止电泳，放入暗箱紫外投射仪观测。具体电压与时间参考如下：
影响 DNA 的迁移效率的因素
凝胶浓度
琼脂糖的百分比越高，其形成的凝胶分子孔径越小，DNA 迁移率越低；反之，迁移率越大。凝胶浓度还与凝胶的分辨率相关，浓度越大，分辨率越高，但可分离的 DNA 片段越小。
DNA 分子的大小
在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。因此，通过将已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，就能测出未知片段的大小。
DNA 的构象
共价闭环 DNA（covalently closed circular，cccDNA）＞直线 DNA＞开环的双链环状 DNA。这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，同时也受电流强度、缓冲液离子强度等因素的影响。
使用的电压
低电压时，线状 DNA 片段迁移率与所用电压成正比。然而，当电场强度升高时，高分子质量 DNA 片段的迁移率并非成比例增加。所以，电压增大时，琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。若要获得大于 2kb DNA 片段的良好分辨率，所用电压不应高于 5 - 8V/cm。
电泳缓冲液
DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。若缺乏离子（如用水替代电泳槽及凝胶中的缓冲液），电导率会降至很低，导致 DNA 迁移极慢甚至完全不动。高离子强度时（如错用了 10X 电泳缓冲液），电导率升高，即便使用适中的电压也会产生大量热量，最严重的情况是凝胶会熔化，DNA 会变性。
注意事项
缓冲液的使用
使用水替代凝胶缓冲液或电泳缓冲液是不可取的。通常，琼脂糖凝胶制备和电泳需要使用 TAE 或 TBE 缓冲液。若使用水，凝胶在电泳过程中会迅速融化。因此，在配制凝胶时，务必检查容器标签，确保使用正确的缓冲液。
琼脂糖浓度
使用错误浓度的琼脂糖会影响实验结果。标准的 DNA 凝胶电泳所需琼脂糖浓度为 1.0%。浓度越高，可获得更高分辨率的小片段；反之，浓度越低，可获得更高分离程度和分辨率的大片段。使用错误浓度的琼脂糖凝胶会降低 DNA 条带的可靠性。需注意，低百分比浓度的琼脂糖凝胶质地较软，更容易破损。
电泳槽与电源连接线
注意正确连接电泳槽与电源连接线的方向。若不小心颠倒连接线的方向，样品会朝相反方向移动，导致样品丢失。
缓冲液类型选择
选择适合实验的正确缓冲液非常重要。常用的缓冲液类型包括 TAE 和 TBE，选择依据 DNA 片段大小和实验后的应用而定。
上样量确定
为获得最佳分辨率，需要根据 DNA 含量确定上样量。最小可检测的 DNA 量取决于使用的染色方法，例如使用 SYBR Safe DNA 凝胶染色可以检测到 3ng 的 DNA。
凝胶配制相关
凝胶的配制会影响条带的分辨率。推荐的凝胶厚度为 3 - 4mm，过厚的凝胶会产生模糊的条带和较高的染色背景。梳齿的厚度也很关键，薄梳齿可产生清晰的条带，而厚梳齿会导致分辨率降低。
电泳运行条件
选择适当的电泳运行条件至关重要，包括电压和距离。推荐的电压范围是 4 - 10V/cm，电压太低会降低迁移率，电压太高会降低分辨率。
水平电泳仪
原理
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为介质，对不同大小的 DNA 或 RNA 进行分离的电泳方法。琼脂糖是一种多糖，具有亲水性且不带电荷。核酸分子属于两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（如 pH8.0 的缓冲液）中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，使得核酸分子带负电荷。在电流作用下，以琼脂糖凝胶为介质，核酸分子从负极向正极移动。由于不同的 DNA 分子片段在大小和形状上存在差异，它们在电场中的泳动速率各不相同。同时，在样品中加入染料（如 EB 或花青素类染料），染料能够和 DNA 分子形成络合物，经过紫外照射后，可以观察到 DNA 的位置（通过与 marker 比对可知分子量大小），进而达到分离、鉴定的目的。
DNA 凝胶电泳的步骤
仪器耗材
核酸电泳仪、电泳槽、暗箱紫外投射仪、梳子、微波炉、三角瓶、试剂瓶、移液枪、枪头。
电泳缓冲液
50xTAE 配方（1L 用量）：
Tris：242g
冰醋酸：57.1mL
EDTA(0.5mol/L)(pH8.0)：100mL
8L1XTAE 配置：
取 160 mL50XTAE，加入 ddH₂O 至 8L，充分混匀后使用。
胶浓度选择
电泳
100 mL 的 1% 琼脂糖凝胶电泳液的配制：
称取 1g 琼脂糖置于干净的三角瓶中，加入 100 mL1XTAE 电泳缓冲液（注意液体不得超过三角瓶容积的三分之一，以免沸腾后溢出），轻轻晃动使其混合均匀后，放入微波炉（中高火）加热。在沸腾间隙拿出缓慢水平摇晃，这样既能加快琼脂糖溶化，又能避免水分过量蒸发（操作时小心烫手）。待琼脂糖颗粒全部溶解后，取出晾凉至 55℃备用（注意防止烫伤）。可根据所需的胶浓度计算并称取相应质量的琼脂糖。
加样准备：
加 10μL（1:10000，染料已稀释 2 倍）GelRed 于制胶模上，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，用玻璃棒将其混合均匀。在适当位置插入梳齿（产物上样量：小梳齿 3 - 10 μL，中梳齿 10 - 30μL，大梳齿 30 - 50μL），于室温下凝固（大约 30 min）。
上样电泳：
待胶凝好后，垂直向上拔出梳齿，然后将胶放入电泳槽内，使样品孔靠近阴极端（黑色电极）。加入 1XTAE 电泳缓冲液至液面刚好覆盖凝胶。将 DNA 样品用移液器小心加入点样孔，每加一个样品要及时更换枪头。注意：在载体构建中菌 P 时，枪头每次上样后可在电泳液中吸打两次后继续点样；其余样品上样时需更换枪头。加样后，合上电泳槽盖，确认阴阳极电源线连接正确（黑对黑，红对红），打开电泳仪开关，以恒定电压模式开始电泳。电压一般设为 130V，定时 20min，当指示剂带移近胶前沿（1 - 2cm）时停止电泳，放入暗箱紫外投射仪观测。具体电压与时间参考如下：
影响 DNA 的迁移效率的因素
凝胶浓度
琼脂糖的百分比越高，其形成的凝胶分子孔径越小，DNA 迁移率越低；反之，迁移率越大。凝胶浓度还与凝胶的分辨率相关，浓度越大，分辨率越高，但可分离的 DNA 片段越小。
DNA 分子的大小
在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。因此，通过将已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，就能测出未知片段的大小。
DNA 的构象
共价闭环 DNA（covalently closed circular，cccDNA）＞直线 DNA＞开环的双链环状 DNA。这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，同时也受电流强度、缓冲液离子强度等因素的影响。
使用的电压
低电压时，线状 DNA 片段迁移率与所用电压成正比。然而，当电场强度升高时，高分子质量 DNA 片段的迁移率并非成比例增加。所以，电压增大时，琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。若要获得大于 2kb DNA 片段的良好分辨率，所用电压不应高于 5 - 8V/cm。
电泳缓冲液
DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。若缺乏离子（如用水替代电泳槽及凝胶中的缓冲液），电导率会降至很低，导致 DNA 迁移极慢甚至完全不动。高离子强度时（如错用了 10X 电泳缓冲液），电导率升高，即便使用适中的电压也会产生大量热量，最严重的情况是凝胶会熔化，DNA 会变性。
注意事项
缓冲液的使用
使用水替代凝胶缓冲液或电泳缓冲液是不可取的。通常，琼脂糖凝胶制备和电泳需要使用 TAE 或 TBE 缓冲液。若使用水，凝胶在电泳过程中会迅速融化。因此，在配制凝胶时，务必检查容器标签，确保使用正确的缓冲液。
琼脂糖浓度
使用错误浓度的琼脂糖会影响实验结果。标准的 DNA 凝胶电泳所需琼脂糖浓度为 1.0%。浓度越高，可获得更高分辨率的小片段；反之，浓度越低，可获得更高分离程度和分辨率的大片段。使用错误浓度的琼脂糖凝胶会降低 DNA 条带的可靠性。需注意，低百分比浓度的琼脂糖凝胶质地较软，更容易破损。
电泳槽与电源连接线
注意正确连接电泳槽与电源连接线的方向。若不小心颠倒连接线的方向，样品会朝相反方向移动，导致样品丢失。
缓冲液类型选择
选择适合实验的正确缓冲液非常重要。常用的缓冲液类型包括 TAE 和 TBE，选择依据 DNA 片段大小和实验后的应用而定。
上样量确定
为获得最佳分辨率，需要根据 DNA 含量确定上样量。最小可检测的 DNA 量取决于使用的染色方法，例如使用 SYBR Safe DNA 凝胶染色可以检测到 3ng 的 DNA。
凝胶配制相关
凝胶的配制会影响条带的分辨率。推荐的凝胶厚度为 3 - 4mm，过厚的凝胶会产生模糊的条带和较高的染色背景。梳齿的厚度也很关键，薄梳齿可产生清晰的条带，而厚梳齿会导致分辨率降低。
电泳运行条件
选择适当的电泳运行条件至关重要，包括电压和距离。推荐的电压范围是 4 - 10V/cm，电压太低会降低迁移率，电压太高会降低分辨率。
