肝癌细胞富含脂滴是该癌种的显著特征。肝癌细胞由于快速增殖，需要动员储存在脂滴中的脂质，通过线粒体脂肪酸氧化磷酸化来产生能量，以满足其快速增殖的需求。然而，肿瘤细胞如何调节脂滴与线粒体的相互作用目前尚不明确。
2024年5月，浙江大学转化医学研究院/浙江大学医学院附属第一医院/国家基础科学中心/浙江大学基础交叉研究院吕志民教授/许大千研究员团队在Nature Metabolism上，发表“Glycolytic enzyme PFKL governs lipolysis by promoting lipid droplet–mitochondria tethering to enhance β-oxidation and tumor cell proliferation”的研究成果，揭示了糖酵解酶PFKL的非经典蛋白激酶功能，通过脂滴脂解促癌的新机制 。
图形摘要：
Highlights如下：
1）PFKL 在正常情况下是糖酵解的关键酶，但在葡萄糖剥夺条件下，它还可以作为蛋白激酶，调节脂滴的降解和脂肪酸的 β 氧化。
2）PFKL 促进脂滴降解和脂肪酸 β 氧化，为肿瘤细胞提供能量和生存优势。
3）机制上， 葡萄糖剥夺后，活化的p38 MAPK磷酸化PFKL的Thr331位点，PFKL在脂滴上作为蛋白激酶，磷酸化PLIN2的Ser159位点，促进PLIN2与线粒体膜蛋白肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）结合，促进了脂滴与线粒体的相互作用，并招募脂肪酶ATGL至脂滴-线粒体接触区域，从而启动脂肪分解以及线粒体脂肪酸氧化磷酸化。
临床相关性：PFKL Thr331的磷酸化水平与HCC患者的生存率较差呈正相关。
功能研究：PFKL促进肿瘤细胞增殖、凋亡，并减缓小鼠肝肿瘤生长，干扰则结果相反。
机制研究：
（1）PFKL通过促进PLIN2与CPT1A的相互作用，促进线粒体偶联脂滴的脂解过程
第一步，脂滴中确定目标蛋白分子
为了解线粒体偶联脂滴的脂解作用，使用葡萄糖剥夺的HCC细胞模型，纯化细胞脂滴，进行质谱检测和分析，结果发现和脂滴相互作用的线粒体外膜蛋白CPT1A（图1a）。该蛋白负责催化长链脂肪酸辅酶a (CoA)，将酰基限速转移到肉碱上，可能是参与线粒体偶联脂滴的重要分子。
第二步，确定PLIN2与CPT1A相互作用及其对脂滴/线粒体偶联的影响
内源Co-IP实验显示，脂滴包被蛋白PLIN2与CPT1A结合（图1b-c）。活细胞成像分析显示，在葡萄糖剥夺时，CPT1A相关的线粒体被招募到PLIN2包被的脂滴上（图1d）。敲减CPT1A阻断了脂滴与线粒体之间的欧联，同时葡萄糖剥夺的总脂滴增加（图1e-f）。这些结果表明PLIN2和CPT1A的相互作用对脂滴与线粒体的结合以及随后的脂滴水解至关重要。
第三步，葡萄糖剥夺，增强了PFKL与PLIN2结合，这对PLIN2和CPT1A互作、脂滴/线粒体的偶联、脂滴脂解至关重要。
为了探索葡萄糖剥夺是否影响PLIN2与CPT1A互作。Co-IP分析发现，使用糖酵解代谢物处理葡萄糖剥夺的细胞不影响PLIN2与CPT1A的结合（图1g），表明葡萄糖剥夺诱导的PLIN2和CPT1A互作与糖酵解代谢产物无关。
脂滴提取物质谱分析显示PFKL是一种脂滴相关蛋白（图1a），在HCC中高表达。Co-IP实验发现，葡萄糖剥夺增强PFKL与PLIN2结合（图1h）。免疫荧光显示葡萄糖剥夺后PFKL与PLIN2共定位（图1i）。IP-WB检测显示PFKL在葡萄糖缺乏条件下与脂滴结合（图1j）。表明葡萄糖剥夺诱导PFKL与脂滴上的PLIN2结合。
另外，Co-IP分析提示，敲减PFKL抑制了葡萄糖剥夺诱导的PLIN2与CPT1A互作（图1k）、脂滴和线粒体之间的系结（图1l）以及总脂滴的减少（图1m）。
图1 PFKL是PLIN2与CPT1A相互作用、脂滴-线粒体系结和脂滴脂解的必需物质（Ref. Fig 1/S1）
以上这些机制研究表明PFKL通过PLIN2和CPT1A相互作用，促进脂滴/线粒体偶联的脂解过程。
（2）PFKL作为蛋白激酶并磷酸化PLIN2的Ser159位点
第一步，葡萄糖剥夺增加p38与PFKL的结合
为了确定PFKL与PLIN2结合的机制，分别抑制p38、JNK1/2、MEK和AMPK，只有p38抑制降低葡萄糖剥夺诱导的PFKL与PLIN2互作（图2a）。Co-IP实验显示，葡萄糖剥夺增加了p38与PFKL的结合（图2b）。
第二步，确定p38磷酸化PFKL Thr331位点
在体外磷酸化实验发现纯化的活性p38可磷酸化纯化的PFKL（图2c）。质谱分析表明，p38磷酸化PFKL的Thr331位点（图2d）。通过特异性PFKL-pT331抗体检测，Thr331突变为丙氨酸可消除p38介导的PFKL磷酸化（图2e-f）。
第三步，确定PFKL Thr331位点磷酸化是PFKL和PLIN2互作所必需的
另外，内源性Co-IP实验显示，敲减PFKL或抑制p38消除了葡萄糖剥夺增强的PFKL-Thr331磷酸化（图2g）。此外，T331A突变阻断了葡萄糖剥夺诱导的PFKL与PLIN2的结合（图2h）。表明p38介导的PFKL-Thr331磷酸化是葡萄糖饥饿时PFKL和PLIN2相互作用所必需的。
第四步，PFKL Thr331磷酸化导致PFKL四聚体转化为单体
研究显示PFKL形成四聚体。分子动力学模拟分析显示，Thr331磷酸化的PFKL二聚体不稳定，表明Thr331磷酸化影响了PFKL四聚体的稳定性（图2i）。Co-IP实验显示野生型与野生型PFKL互作（图2j）；而葡萄糖剥夺减少该互作，这种减少被p38抑制所阻断；PFKL(T331A)突变则仍保持其细胞内相互作用（图2j）。此外，细胞免疫沉淀Flag-PFKL的排阻色谱显示，葡萄糖剥夺增加了野生型PFKL的四聚体转化为单体，而不是PFKL(T331A)（图2k）。在体外，p38与纯化的PFKL孵育将野生型PFKL转化为单体，而不是PFKL-T331A（图2l）。表明p38磷酸化PFKL的Thr331位点，导致PFKL四聚体转化为单体。
图2 葡萄糖剥夺增加p38与PFKL的结合，磷酸化PFKL的Thr331位点（Ref. Fig 2/S3）
第五步，PFKL Thr331磷酸化降低PFK活性
四聚体的形成是PFK活性的必要条件。Thr331磷酸化的PFKL和PFKL(T331D)降低代谢活性、葡萄糖消耗、乳酸生成和细胞外酸化速率(ECAR)（图3a-c），而PFKL(T331A)表达则无影响（图3a-e）。表明，p38介导的PFKL Thr331磷酸化降低了PFKL和糖酵解的糖酵解活性。
第六步，代谢酶具有蛋白激酶的功能，PFKL磷酸化PLIN2的Ser159位点
前面提到，PFKL与PLIN2互作，那么PFKL如何影响PLIN2？体外磷酸化实验显示，野生型和F638R（代谢酶失活突变）PFKL可磷酸化PLIN2，而其激酶失活突变体R210A则不能磷酸化PLIN2（图3f）；p38磷酸化野生型PFKL（而不是T331A突变体），能磷酸化PLIN2（图3g）。此外，PFKL(T331D)对PLIN2表现出更高的激酶活性（图3h）。
质谱分析表明，PLIN2进化上保守的Ser159位点被PFKL磷酸化，S159A突变在体外消除了PFKL介导的PLIN2磷酸化（图3i）。内源性Co-IP实验显示PLIN2缺失后，葡萄糖剥夺增强了外源PLIN2-Ser159磷酸化，而外源S159A突变体则不能（图3j）。表明PFKL作为一种蛋白激酶可以磷酸化PLIN2-Ser159。此外，分子动力学模拟揭示，磷酸化的PFKL催化结构域发生改变（图3k）。
这些结果表明p38磷酸化的PFKL改变了其催化结构域的结构，使PLIN2磷酸化，同时抑制其代谢活性。
（3）PFKL介导的PLIN2-Ser159磷酸化促进PLIN2与CPT1A互作、脂滴/线粒体偶联、β-氧化作用
第一步，PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化促进PLIN2与CPT1A互作
为了检测PLIN2-Ser159磷酸化在PLIN2-CPT1A复合物形成中的功能。GST pulldown实验显示，PFKL磷酸化的野生型PLIN2与CPT1A结合，但PLIN2(S159A)没有（图3l）。此外，在葡萄糖剥夺反应中，外源表达的rPLIN2(S159A)与CPT1A的结合大大降低（图3m）。外源表达PFKL(T331A)降低了葡萄糖剥夺诱导的PLIN2和CPT1A之间的相互作用（图3n）。表明p38磷酸化的PFKL，通过磷酸化PLIN2 -Ser159，促进PLIN2和CPT1A之间的关联。
第二步，PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化促进脂滴-线粒体系固和β-氧化的相互作用
PLIN2-S159A的表达阻断了脂滴、线粒体的结合（图3o），减少了荧光脂肪酸类似物从脂滴到线粒体的运输（图3p）。表明PFKL介导的PLIN2-Ser159磷酸化促进脂滴和线粒体的结合，以及脂滴脂肪酸的线粒体易位。
第三步，PFKL磷酸化的PLIN2更容易招募ATGL进行脂解
细胞质ATGL对于脂滴的脂溶消耗和脂肪酸从脂滴到线粒体的运输至关重要。葡萄糖剥夺后，ATGL在脂滴/线粒体的系带区积累（图3q）。体外将PFKL与野生型PLIN2或表达PLIN2-S159A的细胞中提取的脂滴孵育，加入ATGL，PFKL磷酸化的野生型PLIN2脂滴招募了更多的ATGL（图3r）。表明ATGL在CPT1A-PLIN2相互作用介导的脂滴消耗中起着至关重要的作用。
图3 激酶功能PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化促进了PLIN2与CPT1A、脂滴-线粒体系结和β-氧化的相互作用（Ref. Fig3/S4-5）
结论：在本研究中，PFKL 在正常情况下是糖酵解的关键酶，但在葡萄糖剥夺条件下，功能和机制进行了转变，通过蛋白激酶分子活性，发挥调节脂滴降解和脂肪酸的β 氧化的新功能，促进肿瘤生长和转移。机制上，葡萄糖剥夺诱导PFKL的磷酸化，降低其活性并增加其与PLIN2的相互作用，随后磷酸化的PFKL磷酸化 PLIN2，以促进 PLIN2 与CPT1A的结合，导致脂滴和线粒体的偶联，并且ATGL被招募到脂滴/线粒体偶联的束缚区域，通过参与脂肪酸氧化，来支持肿瘤细胞的生存和增殖。本研究揭示了PFKL 在糖酵解、脂质代谢和线粒体氧化过程中的枢纽调节作用，对靶向肿瘤脂质代谢的抗癌药物开发具有重要的指导意义。
2024年5月，浙江大学转化医学研究院/浙江大学医学院附属第一医院/国家基础科学中心/浙江大学基础交叉研究院吕志民教授/许大千研究员团队在Nature Metabolism上，发表“Glycolytic enzyme PFKL governs lipolysis by promoting lipid droplet–mitochondria tethering to enhance β-oxidation and tumor cell proliferation”的研究成果，揭示了糖酵解酶PFKL的非经典蛋白激酶功能，通过脂滴脂解促癌的新机制 。
图形摘要：
Highlights如下：
1）PFKL 在正常情况下是糖酵解的关键酶，但在葡萄糖剥夺条件下，它还可以作为蛋白激酶，调节脂滴的降解和脂肪酸的 β 氧化。
2）PFKL 促进脂滴降解和脂肪酸 β 氧化，为肿瘤细胞提供能量和生存优势。
3）机制上， 葡萄糖剥夺后，活化的p38 MAPK磷酸化PFKL的Thr331位点，PFKL在脂滴上作为蛋白激酶，磷酸化PLIN2的Ser159位点，促进PLIN2与线粒体膜蛋白肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）结合，促进了脂滴与线粒体的相互作用，并招募脂肪酶ATGL至脂滴-线粒体接触区域，从而启动脂肪分解以及线粒体脂肪酸氧化磷酸化。
临床相关性：PFKL Thr331的磷酸化水平与HCC患者的生存率较差呈正相关。
功能研究：PFKL促进肿瘤细胞增殖、凋亡，并减缓小鼠肝肿瘤生长，干扰则结果相反。
机制研究：
（1）PFKL通过促进PLIN2与CPT1A的相互作用，促进线粒体偶联脂滴的脂解过程
第一步，脂滴中确定目标蛋白分子
为了解线粒体偶联脂滴的脂解作用，使用葡萄糖剥夺的HCC细胞模型，纯化细胞脂滴，进行质谱检测和分析，结果发现和脂滴相互作用的线粒体外膜蛋白CPT1A（图1a）。该蛋白负责催化长链脂肪酸辅酶a (CoA)，将酰基限速转移到肉碱上，可能是参与线粒体偶联脂滴的重要分子。
第二步，确定PLIN2与CPT1A相互作用及其对脂滴/线粒体偶联的影响
内源Co-IP实验显示，脂滴包被蛋白PLIN2与CPT1A结合（图1b-c）。活细胞成像分析显示，在葡萄糖剥夺时，CPT1A相关的线粒体被招募到PLIN2包被的脂滴上（图1d）。敲减CPT1A阻断了脂滴与线粒体之间的欧联，同时葡萄糖剥夺的总脂滴增加（图1e-f）。这些结果表明PLIN2和CPT1A的相互作用对脂滴与线粒体的结合以及随后的脂滴水解至关重要。
第三步，葡萄糖剥夺，增强了PFKL与PLIN2结合，这对PLIN2和CPT1A互作、脂滴/线粒体的偶联、脂滴脂解至关重要。
为了探索葡萄糖剥夺是否影响PLIN2与CPT1A互作。Co-IP分析发现，使用糖酵解代谢物处理葡萄糖剥夺的细胞不影响PLIN2与CPT1A的结合（图1g），表明葡萄糖剥夺诱导的PLIN2和CPT1A互作与糖酵解代谢产物无关。
脂滴提取物质谱分析显示PFKL是一种脂滴相关蛋白（图1a），在HCC中高表达。Co-IP实验发现，葡萄糖剥夺增强PFKL与PLIN2结合（图1h）。免疫荧光显示葡萄糖剥夺后PFKL与PLIN2共定位（图1i）。IP-WB检测显示PFKL在葡萄糖缺乏条件下与脂滴结合（图1j）。表明葡萄糖剥夺诱导PFKL与脂滴上的PLIN2结合。
另外，Co-IP分析提示，敲减PFKL抑制了葡萄糖剥夺诱导的PLIN2与CPT1A互作（图1k）、脂滴和线粒体之间的系结（图1l）以及总脂滴的减少（图1m）。
图1 PFKL是PLIN2与CPT1A相互作用、脂滴-线粒体系结和脂滴脂解的必需物质（Ref. Fig 1/S1）
以上这些机制研究表明PFKL通过PLIN2和CPT1A相互作用，促进脂滴/线粒体偶联的脂解过程。
（2）PFKL作为蛋白激酶并磷酸化PLIN2的Ser159位点
第一步，葡萄糖剥夺增加p38与PFKL的结合
为了确定PFKL与PLIN2结合的机制，分别抑制p38、JNK1/2、MEK和AMPK，只有p38抑制降低葡萄糖剥夺诱导的PFKL与PLIN2互作（图2a）。Co-IP实验显示，葡萄糖剥夺增加了p38与PFKL的结合（图2b）。
第二步，确定p38磷酸化PFKL Thr331位点
在体外磷酸化实验发现纯化的活性p38可磷酸化纯化的PFKL（图2c）。质谱分析表明，p38磷酸化PFKL的Thr331位点（图2d）。通过特异性PFKL-pT331抗体检测，Thr331突变为丙氨酸可消除p38介导的PFKL磷酸化（图2e-f）。
第三步，确定PFKL Thr331位点磷酸化是PFKL和PLIN2互作所必需的
另外，内源性Co-IP实验显示，敲减PFKL或抑制p38消除了葡萄糖剥夺增强的PFKL-Thr331磷酸化（图2g）。此外，T331A突变阻断了葡萄糖剥夺诱导的PFKL与PLIN2的结合（图2h）。表明p38介导的PFKL-Thr331磷酸化是葡萄糖饥饿时PFKL和PLIN2相互作用所必需的。
第四步，PFKL Thr331磷酸化导致PFKL四聚体转化为单体
研究显示PFKL形成四聚体。分子动力学模拟分析显示，Thr331磷酸化的PFKL二聚体不稳定，表明Thr331磷酸化影响了PFKL四聚体的稳定性（图2i）。Co-IP实验显示野生型与野生型PFKL互作（图2j）；而葡萄糖剥夺减少该互作，这种减少被p38抑制所阻断；PFKL(T331A)突变则仍保持其细胞内相互作用（图2j）。此外，细胞免疫沉淀Flag-PFKL的排阻色谱显示，葡萄糖剥夺增加了野生型PFKL的四聚体转化为单体，而不是PFKL(T331A)（图2k）。在体外，p38与纯化的PFKL孵育将野生型PFKL转化为单体，而不是PFKL-T331A（图2l）。表明p38磷酸化PFKL的Thr331位点，导致PFKL四聚体转化为单体。
图2 葡萄糖剥夺增加p38与PFKL的结合，磷酸化PFKL的Thr331位点（Ref. Fig 2/S3）
第五步，PFKL Thr331磷酸化降低PFK活性
四聚体的形成是PFK活性的必要条件。Thr331磷酸化的PFKL和PFKL(T331D)降低代谢活性、葡萄糖消耗、乳酸生成和细胞外酸化速率(ECAR)（图3a-c），而PFKL(T331A)表达则无影响（图3a-e）。表明，p38介导的PFKL Thr331磷酸化降低了PFKL和糖酵解的糖酵解活性。
第六步，代谢酶具有蛋白激酶的功能，PFKL磷酸化PLIN2的Ser159位点
前面提到，PFKL与PLIN2互作，那么PFKL如何影响PLIN2？体外磷酸化实验显示，野生型和F638R（代谢酶失活突变）PFKL可磷酸化PLIN2，而其激酶失活突变体R210A则不能磷酸化PLIN2（图3f）；p38磷酸化野生型PFKL（而不是T331A突变体），能磷酸化PLIN2（图3g）。此外，PFKL(T331D)对PLIN2表现出更高的激酶活性（图3h）。
质谱分析表明，PLIN2进化上保守的Ser159位点被PFKL磷酸化，S159A突变在体外消除了PFKL介导的PLIN2磷酸化（图3i）。内源性Co-IP实验显示PLIN2缺失后，葡萄糖剥夺增强了外源PLIN2-Ser159磷酸化，而外源S159A突变体则不能（图3j）。表明PFKL作为一种蛋白激酶可以磷酸化PLIN2-Ser159。此外，分子动力学模拟揭示，磷酸化的PFKL催化结构域发生改变（图3k）。
这些结果表明p38磷酸化的PFKL改变了其催化结构域的结构，使PLIN2磷酸化，同时抑制其代谢活性。
（3）PFKL介导的PLIN2-Ser159磷酸化促进PLIN2与CPT1A互作、脂滴/线粒体偶联、β-氧化作用
第一步，PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化促进PLIN2与CPT1A互作
为了检测PLIN2-Ser159磷酸化在PLIN2-CPT1A复合物形成中的功能。GST pulldown实验显示，PFKL磷酸化的野生型PLIN2与CPT1A结合，但PLIN2(S159A)没有（图3l）。此外，在葡萄糖剥夺反应中，外源表达的rPLIN2(S159A)与CPT1A的结合大大降低（图3m）。外源表达PFKL(T331A)降低了葡萄糖剥夺诱导的PLIN2和CPT1A之间的相互作用（图3n）。表明p38磷酸化的PFKL，通过磷酸化PLIN2 -Ser159，促进PLIN2和CPT1A之间的关联。
第二步，PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化促进脂滴-线粒体系固和β-氧化的相互作用
PLIN2-S159A的表达阻断了脂滴、线粒体的结合（图3o），减少了荧光脂肪酸类似物从脂滴到线粒体的运输（图3p）。表明PFKL介导的PLIN2-Ser159磷酸化促进脂滴和线粒体的结合，以及脂滴脂肪酸的线粒体易位。
第三步，PFKL磷酸化的PLIN2更容易招募ATGL进行脂解
细胞质ATGL对于脂滴的脂溶消耗和脂肪酸从脂滴到线粒体的运输至关重要。葡萄糖剥夺后，ATGL在脂滴/线粒体的系带区积累（图3q）。体外将PFKL与野生型PLIN2或表达PLIN2-S159A的细胞中提取的脂滴孵育，加入ATGL，PFKL磷酸化的野生型PLIN2脂滴招募了更多的ATGL（图3r）。表明ATGL在CPT1A-PLIN2相互作用介导的脂滴消耗中起着至关重要的作用。
图3 激酶功能PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化促进了PLIN2与CPT1A、脂滴-线粒体系结和β-氧化的相互作用（Ref. Fig3/S4-5）
结论：在本研究中，PFKL 在正常情况下是糖酵解的关键酶，但在葡萄糖剥夺条件下，功能和机制进行了转变，通过蛋白激酶分子活性，发挥调节脂滴降解和脂肪酸的β 氧化的新功能，促进肿瘤生长和转移。机制上，葡萄糖剥夺诱导PFKL的磷酸化，降低其活性并增加其与PLIN2的相互作用，随后磷酸化的PFKL磷酸化 PLIN2，以促进 PLIN2 与CPT1A的结合，导致脂滴和线粒体的偶联，并且ATGL被招募到脂滴/线粒体偶联的束缚区域，通过参与脂肪酸氧化，来支持肿瘤细胞的生存和增殖。本研究揭示了PFKL 在糖酵解、脂质代谢和线粒体氧化过程中的枢纽调节作用，对靶向肿瘤脂质代谢的抗癌药物开发具有重要的指导意义。
