铁死亡(Ferroptosis)是一种铁离子依赖的,脂质过氧化积累导致的细胞破裂程序性死亡,是一种区别于细胞凋亡坏死的新型细胞死亡方式。靶向铁死亡是开发肿瘤精准治疗的重要路径。
2024年2月,美国哥伦比亚大学顾伟教授团队在Cell Metabolism杂志上,发表“PHLDA2-mediated phosphatidic acid peroxidation triggers a distinct ferroptotic response during tumor suppression”的研究成果,揭示了一种膜结合蛋白PHLDA2(Pleckstrin homology-like domain family A member 2)介导且不依赖于GPX4的新型铁死亡方式。该研究为开发靶向铁死亡的肿瘤精准诊疗提供新的潜在靶点。图形摘要:
Highlights如下:
1)CRISPR/Cas9敲除文库筛选,PHLDA2可以作为关键调控因子参与铁死亡。
2)PHLDA2在免疫缺陷和免疫正常的小鼠模型中抑制肿瘤生长。
3)机制上,PHLDA2通过与ALOX12相互作用,招募其催化PA(长链不饱和脂肪酸)过氧化,促进铁死亡,该过程不依赖于GPX4-ACSL4系统。表型相关性:胱氨酸饥饿或高浓度ROS诱导的铁死亡需要PHLDA2,且不依赖于GPX4-ACSL4轴。
功能研究:敲除PHLDA2后,抑制铁死亡,裸鼠和免疫健全鼠的肿瘤大小和总体肿瘤负荷均急剧增加。
机制研究:
(1)分子互作基础
课题组前期研究发现,催化多不饱和脂肪酸(PUFAs)氧合的12-脂氧合酶(ALOX12)是高水平ROS诱导的铁死亡应答的关键因子。在本研究中,PHLDA2是否通过ALOX12的ROS调控系统诱导铁死亡。
第一步,确定ROS铁死亡系统的相互作用分子
通过SFB标签抗体,进行IP-MS和IP-WB发现PHLDA2与ALOX12互作(图1a、b)。进一步通过内源抗体Co-IP双向验证PHLDA2与ALOX12存在相互作用(图1c-d)。而免疫荧光共定位实验发现PHLDA2和ALOX12能够同时共定位于细胞质(图1e),进一步佐证了PHLDA2-ALOX12复合体的存在。
第二步,确定PHLDA2和ALOX12互作特异性
PHLDA2属于PH样结构域家族A,包括PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3(图1f)。Co-IP实验分析发现,PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3中,只有PHLDA2与ALOX12相互作用(图1h-i)。
图1 PHLDA2与ALOX12相互作用(Ref. Fig 2/S2)
第三步,确定互作的结构域(严谨)
为了确定PHLDA2与ALOX12互作的结构域,对PHLDA2分别构建PHLDA2全长、PHLDA2-PH、PHLDA2-ΔPH进行GST pulldown和Co-IP实验,发现ALOX12结合含有N端PH结构域(aa7-101),但不结合含有C端结构域(ΔPH,aa102-152)(图2a-c)。另外,对PHLDA2分别构建PHLDA2全长、PHLDA2-BS、PHLDA2-ΔBS进行Co-IP实验分析,发现PHLDA2的高度保守的磷脂结合序列(BS,aa7-31)不是与ALOX12相互作用所必需的,但其旁边的一个小区域(ΔBS,aa32-101)是ALOX12的主要对接位点(图2a和2d)。
图2 PHLDA2通过与ALOX12互作,在ROS诱导的铁死亡中发挥重要作用(Ref. Fig2/S2)
以上结果证实:PHLDA2与ALOX12直接相互作用。ALOX12是ROS铁死亡的催化酶,这种互作是调控铁死亡必须的吗?需要进一步探究!
(2)PHLDA2与ALOX12的相互作用是否是铁死亡所必需的
第一步,PHLDA2与ALOX12功能相关性
建立ALOX12-tet-on细胞。ALOX12促进了细胞铁死亡,在失去PHLDA2后,ALOX12诱导的铁死亡水平显著降低(图2e),脂质过氧化水平也被消除(图2f)。表明ALOX12介导的脂质过氧化和铁死亡依赖于PHLDA2的表达。
第二步,PHLDA2与ALOX12的互作是诱导铁死亡所必需的
另外,PHLDA2缺失后,野生型(WT) PHLDA2的表达恢复了铁死亡应答,而单独重新表达与ALOX12结合的PHLDA2-PH亦足以恢复铁死亡反应,PHLDA2-ΔPH则不能(图2g)。在人类肿瘤标本COSMIC数据库中,在PHLDA2的ΔBS结构域发现了两个进化上保守的错义突变位点:R35H和R46P,可能对PHLDA2/ALOX12复合体产生功能影响(有参考价值的研究动作)。Co-IP实验分析显示,R46P突变破坏了ALOX12与PHLDA2的结合,而R35H突变则没有影响(图2h)。此外,R46P突变体不能有效挽救PHLDA2缺失细胞中的铁死亡活性(图2i)。
以上结果表明:PHLDA2与ALOX12的互作对于高水平ROS诱导的铁死亡是必不可少的。那么,这种互作是如何调控ROS铁死亡的?
(3)PHLDA2与ALOX12的互作如何启动铁死亡
铁死亡是由膜磷脂上的多不饱和脂肪酸部分过度过氧化引起的。常见的铁死亡反应由GPX4依赖和非GPX4依赖两种方式调节,前者主要有三种磷脂(磷脂酰乙醇胺[PE]、磷脂酰丝氨酸[PS]和磷脂酰肌醇[PI])参与铁死亡。PHLDA2是一种对磷脂具有高亲和力的膜相关蛋白,ALOX12能够通过其脂氧合酶活性特异性氧化游离的多不饱和脂肪酸。那么,不依赖GPX4的PHLDA2是如何启动铁死亡的。
第一步,PHLDA2能够将ALOX12募集到特定的磷脂上研究PHLDA2与不同类型磷脂的结合亲和力,发现PHLDA2对PA、PS、PI和PI磷酸化衍生物(PIP)表现出高亲和力(图3a)。此外,虽然ALOX12不直接结合任何磷脂,但ALOX12-PHLDA2复合物显示出与PHLDA2相同的结合模式,表明PHLDA2能够将ALOX12募集到特定的磷脂上(图3b)。
第二步,ALOX12和ALOX12/PHLDA2复合物对磷脂的氧化活性
检测发现PHLDA2对ALOX12介导的不同类别磷脂的脂质过氧化有显著影响,其中PHLDA2能显著增强ALOX12催化的花生四烯酸酯化磷脂(18:0/20:4-PA)的过氧化,抑制ALOX12的活性诱导PE或PC的过氧化(图3c-e)。表明PHLDA2可显著增强ALOX12的活性,诱导SAPA过氧化,与其与PA的强结合一致。说明PHLDA2通过其选择性结合磷脂的能力调控ALOX12对于磷脂的选择性过氧化。
第三步,ALOX12/PHLDA2过氧化PA是否直接刺激铁死亡
在ACSL4/GPX4双敲除细胞中孵育含有18:0/20:4-PA的脂质体(图3f)。在PHLDA2和ALOX12共表达后,PA诱导了高水平的铁死亡(图3g)。表明PHLDA2/ALOX12复合物可以通过催化PUFA-PA的过氧化在没有经典铁死亡诱导剂的条件下启动铁死亡。
图3 PHLDA2 优先与 PA 结合进行磷脂过氧化反应,启动铁死亡(Ref. Fig3/S3)
以上结果表明:PHLDA2是通过招募ALOX12到细胞膜附近,促使更容易催化脂质氧化,从而诱发ROS铁死亡。证据链步步为营,充分证明PHLDA2在ALOX12调控铁死亡中的价值!
结论:本研究通过 CRISPR/Cas9 敲除文库筛选发现PHLDA2参与不依赖于ACSL4的ROS铁死亡。功能上,PHLDA2在免疫缺陷和免疫正常的小鼠模型中抑制肿瘤生长。机制上,PHLDA2通过PH结构域与ALOX12互作,并将其募集到磷脂上,调控ALOX12催化带有长链不饱和脂肪酸的过氧化,在没有经典铁死亡诱导剂的条件下,就能充分的启动铁死亡,抑制肿瘤进展。该研究为肿瘤治疗中靶向铁死亡提供了新思路和新靶点。
2024年2月,美国哥伦比亚大学顾伟教授团队在Cell Metabolism杂志上,发表“PHLDA2-mediated phosphatidic acid peroxidation triggers a distinct ferroptotic response during tumor suppression”的研究成果,揭示了一种膜结合蛋白PHLDA2(Pleckstrin homology-like domain family A member 2)介导且不依赖于GPX4的新型铁死亡方式。该研究为开发靶向铁死亡的肿瘤精准诊疗提供新的潜在靶点。图形摘要:
Highlights如下:
1)CRISPR/Cas9敲除文库筛选,PHLDA2可以作为关键调控因子参与铁死亡。
2)PHLDA2在免疫缺陷和免疫正常的小鼠模型中抑制肿瘤生长。
3)机制上,PHLDA2通过与ALOX12相互作用,招募其催化PA(长链不饱和脂肪酸)过氧化,促进铁死亡,该过程不依赖于GPX4-ACSL4系统。表型相关性:胱氨酸饥饿或高浓度ROS诱导的铁死亡需要PHLDA2,且不依赖于GPX4-ACSL4轴。
功能研究:敲除PHLDA2后,抑制铁死亡,裸鼠和免疫健全鼠的肿瘤大小和总体肿瘤负荷均急剧增加。
机制研究:
(1)分子互作基础
课题组前期研究发现,催化多不饱和脂肪酸(PUFAs)氧合的12-脂氧合酶(ALOX12)是高水平ROS诱导的铁死亡应答的关键因子。在本研究中,PHLDA2是否通过ALOX12的ROS调控系统诱导铁死亡。
第一步,确定ROS铁死亡系统的相互作用分子
通过SFB标签抗体,进行IP-MS和IP-WB发现PHLDA2与ALOX12互作(图1a、b)。进一步通过内源抗体Co-IP双向验证PHLDA2与ALOX12存在相互作用(图1c-d)。而免疫荧光共定位实验发现PHLDA2和ALOX12能够同时共定位于细胞质(图1e),进一步佐证了PHLDA2-ALOX12复合体的存在。
第二步,确定PHLDA2和ALOX12互作特异性
PHLDA2属于PH样结构域家族A,包括PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3(图1f)。Co-IP实验分析发现,PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3中,只有PHLDA2与ALOX12相互作用(图1h-i)。
图1 PHLDA2与ALOX12相互作用(Ref. Fig 2/S2)
第三步,确定互作的结构域(严谨)
为了确定PHLDA2与ALOX12互作的结构域,对PHLDA2分别构建PHLDA2全长、PHLDA2-PH、PHLDA2-ΔPH进行GST pulldown和Co-IP实验,发现ALOX12结合含有N端PH结构域(aa7-101),但不结合含有C端结构域(ΔPH,aa102-152)(图2a-c)。另外,对PHLDA2分别构建PHLDA2全长、PHLDA2-BS、PHLDA2-ΔBS进行Co-IP实验分析,发现PHLDA2的高度保守的磷脂结合序列(BS,aa7-31)不是与ALOX12相互作用所必需的,但其旁边的一个小区域(ΔBS,aa32-101)是ALOX12的主要对接位点(图2a和2d)。
图2 PHLDA2通过与ALOX12互作,在ROS诱导的铁死亡中发挥重要作用(Ref. Fig2/S2)
以上结果证实:PHLDA2与ALOX12直接相互作用。ALOX12是ROS铁死亡的催化酶,这种互作是调控铁死亡必须的吗?需要进一步探究!
(2)PHLDA2与ALOX12的相互作用是否是铁死亡所必需的
第一步,PHLDA2与ALOX12功能相关性
建立ALOX12-tet-on细胞。ALOX12促进了细胞铁死亡,在失去PHLDA2后,ALOX12诱导的铁死亡水平显著降低(图2e),脂质过氧化水平也被消除(图2f)。表明ALOX12介导的脂质过氧化和铁死亡依赖于PHLDA2的表达。
第二步,PHLDA2与ALOX12的互作是诱导铁死亡所必需的
另外,PHLDA2缺失后,野生型(WT) PHLDA2的表达恢复了铁死亡应答,而单独重新表达与ALOX12结合的PHLDA2-PH亦足以恢复铁死亡反应,PHLDA2-ΔPH则不能(图2g)。在人类肿瘤标本COSMIC数据库中,在PHLDA2的ΔBS结构域发现了两个进化上保守的错义突变位点:R35H和R46P,可能对PHLDA2/ALOX12复合体产生功能影响(有参考价值的研究动作)。Co-IP实验分析显示,R46P突变破坏了ALOX12与PHLDA2的结合,而R35H突变则没有影响(图2h)。此外,R46P突变体不能有效挽救PHLDA2缺失细胞中的铁死亡活性(图2i)。
以上结果表明:PHLDA2与ALOX12的互作对于高水平ROS诱导的铁死亡是必不可少的。那么,这种互作是如何调控ROS铁死亡的?
(3)PHLDA2与ALOX12的互作如何启动铁死亡
铁死亡是由膜磷脂上的多不饱和脂肪酸部分过度过氧化引起的。常见的铁死亡反应由GPX4依赖和非GPX4依赖两种方式调节,前者主要有三种磷脂(磷脂酰乙醇胺[PE]、磷脂酰丝氨酸[PS]和磷脂酰肌醇[PI])参与铁死亡。PHLDA2是一种对磷脂具有高亲和力的膜相关蛋白,ALOX12能够通过其脂氧合酶活性特异性氧化游离的多不饱和脂肪酸。那么,不依赖GPX4的PHLDA2是如何启动铁死亡的。
第一步,PHLDA2能够将ALOX12募集到特定的磷脂上研究PHLDA2与不同类型磷脂的结合亲和力,发现PHLDA2对PA、PS、PI和PI磷酸化衍生物(PIP)表现出高亲和力(图3a)。此外,虽然ALOX12不直接结合任何磷脂,但ALOX12-PHLDA2复合物显示出与PHLDA2相同的结合模式,表明PHLDA2能够将ALOX12募集到特定的磷脂上(图3b)。
第二步,ALOX12和ALOX12/PHLDA2复合物对磷脂的氧化活性
检测发现PHLDA2对ALOX12介导的不同类别磷脂的脂质过氧化有显著影响,其中PHLDA2能显著增强ALOX12催化的花生四烯酸酯化磷脂(18:0/20:4-PA)的过氧化,抑制ALOX12的活性诱导PE或PC的过氧化(图3c-e)。表明PHLDA2可显著增强ALOX12的活性,诱导SAPA过氧化,与其与PA的强结合一致。说明PHLDA2通过其选择性结合磷脂的能力调控ALOX12对于磷脂的选择性过氧化。
第三步,ALOX12/PHLDA2过氧化PA是否直接刺激铁死亡
在ACSL4/GPX4双敲除细胞中孵育含有18:0/20:4-PA的脂质体(图3f)。在PHLDA2和ALOX12共表达后,PA诱导了高水平的铁死亡(图3g)。表明PHLDA2/ALOX12复合物可以通过催化PUFA-PA的过氧化在没有经典铁死亡诱导剂的条件下启动铁死亡。
图3 PHLDA2 优先与 PA 结合进行磷脂过氧化反应,启动铁死亡(Ref. Fig3/S3)
以上结果表明:PHLDA2是通过招募ALOX12到细胞膜附近,促使更容易催化脂质氧化,从而诱发ROS铁死亡。证据链步步为营,充分证明PHLDA2在ALOX12调控铁死亡中的价值!
结论:本研究通过 CRISPR/Cas9 敲除文库筛选发现PHLDA2参与不依赖于ACSL4的ROS铁死亡。功能上,PHLDA2在免疫缺陷和免疫正常的小鼠模型中抑制肿瘤生长。机制上,PHLDA2通过PH结构域与ALOX12互作,并将其募集到磷脂上,调控ALOX12催化带有长链不饱和脂肪酸的过氧化,在没有经典铁死亡诱导剂的条件下,就能充分的启动铁死亡,抑制肿瘤进展。该研究为肿瘤治疗中靶向铁死亡提供了新思路和新靶点。