按语:未来已来,ChatGPT博古通今,如何驾驭工具,与其共舞,乘风破浪,扬帆远航,是每个临床基础科研人员的必答试卷。
正题:
引言:本文是张老师课题组发表在肿瘤领域Top杂志《Molecular Cancer》上的一篇临床基础科研文章,该项目聚焦Hsa_circ_0007919(以下简称circRNA)在胰腺导管腺癌(PDAC)吉西他滨(GEM)耐药中的分子功能和调控机制研究(图1),为解决临床PDAC的GEM耐药提供潜在诊疗转化靶点。
图1. circ-0007919促癌耐药的科学假说(Ref. Fig.8)。
项目Highlights如下:
临床相关性:circRNA在GEM耐药的PDAC组织和细胞中高表达,且高表达与PDAC患者的总生存期和无病生存期差相关。
下游功能靶点:circRNA 以 LIG1 依赖性方式抑制 GEM 诱导的 DNA 损伤、DNA 断裂积累和细胞凋亡。
互作调控机制:circRNA 招募 FOXA1 和 TET1 增强 LIG1 的转录,促进 DNA 损伤应答。
上游产生机制:GEM增强OKI和内含子结合,促进circRNA环化形成。
临床诊疗意义:靶向circRNA和DNA损伤修复途径可能是PDAC的一种潜在治疗策略。
本文侧重:重点对机制研究进行解读,以飨读者。
(1)如何确定circRNA的下游功能靶点LIG1?
图2. 通过RNAseq发现circRNA的转录调控特征,聚焦下游关键功能靶点LIG1(Ref. Fig.4)。
组学发现:作者通过RNA-seq技术,检测沉默circRNA的PANC-1/GEM耐药株细胞与对照细胞,发现739个差异基因,包括520个上调基因和219个下调基因。这些差异基因在多种DNA损伤修复通路中富集,包括碱基切除修复、错配修复和核苷酸切除修复。在这些通路中,包含显著下调的共同基因LIG1。LIG1是DNA连接酶家族的成员,在几乎所有DNA损伤修复通路中发挥着重要作用。
应答检测:在GEM抵抗的PDAC组织中,LIG1也高度表达,并且与PDAC组织中的circRNA表达呈正相关。沉默circRNA后,LIG1的mRNA和蛋白表达水平降低,而过表达则增加LIG1的表达。
回复验证:通过体内和体外实验证实,LIG1能够逆转circRNA对细胞增殖、凋亡和DNA损伤的影响。沉默LIG1会导致细胞增殖减少、凋亡增加和DNA损伤增加,而过表达LIG1则能够逆转由circRNA沉默引起的这些变化。
结论:circRNA通过诱导LIG1的表达来减少DNA损伤、促进细胞增殖和降低凋亡,从而增强细胞对GEM的抵抗性。
(2)circRNA如何调控LIG1转录表达?
图3. 通过CoIP、CHIRP和RIP验证circRNA和FOX1/TET1互作的分子机制(Ref. Fig.6)。
数据库分析筛选:通过FISH和核-细胞质RNA分离实验发现,circRNA主要分布在细胞核中。利用数据库分析发现,circRNA与LIG1启动子的结合蛋白有显著重叠,其中FOXA1是最显著的蛋白。进一步预测与FOXA1共同作用的蛋白,发现TET1与FOXA1结合。
调控互作复合体验证:在GEM耐药株中,CoIP验证FOXA1和TET1相互作用;进一步沉默FOXA1和TET1后,LIG1表达降低,证实在耐药株中FOXA1/TET1复合体协同调控LIG1表达。进一步通过ChIRP和RIP实验证实circRNA能够与FOXA1和TET1蛋白结合。
图4. 通过ChIP和双荧光素酶试验验证circRNA影响FOX1/TET1结合LIG1启动子(Ref. Fig.7)。
调控复合体功能:ChIP实验证实FOXA1和TET1结合在LIG1启动子的甲基化修饰区域,而circRNA的抑制降低了这种结合能力。MS-PCR实验显示,沉默circRNA或TET1增加了LIG1启动子的DNA甲基化水平,而过表达则相反。这些表明circRNA通过影响LIG1启动子甲基化水平,进而影响FOXA1/TET1复合体靶向结合LIG1启动子的能力。荧光素酶报告基因实验表明,沉默circRNA、FOXA1或TET1降低了LIG1启动子的转录活性,而过表达则增强了其转录活性。这些实验进一步表明circRNA/FOXA1/TET1对LIG1的促转录调控功能。
结论:circRNA通过结合FOXA1和TET1增强了LIG1的转录。
(3)circRNA的上调表达是如何被调控的?
图4. 通过RIP验证OKI和内含子结合强度在不同细胞中的差异(Ref. Fig.8)。
调控蛋白检测:circRNA是由其母基因ABR外显子3-16的外显子通过反向剪接生成的。与正常的PDAC组织和细胞相比,GEM耐药的PDAC组织和细胞中circRNA的表达上调。文献表调研明,QKI、FUS和ADAR1多种蛋白质参与circRNA合成过程中的反向剪接。作者研究这些蛋白与GEM耐药PDAC组织中circRNA表达之间的相关性,发现QKI与circRNA的表达呈正相关。进一步在GEM耐药的PDAC细胞中沉默了QKI,发现circRNA的表达下调,但目基因ABR的表达不受影响。这些表明:QKI可能参与促进circRNA的形成。
调控蛋白验证:在正常PDAC细胞和GEM耐药细胞之间,QKI的表达没有差异,但RIP实验结果发现QKI可以与PDAC细胞中的环化内含子结合,且在GEM耐药PDAC细胞中的相互作用显著增强。
结论:GEM通过增强QKI与circRNA两侧内含子之间的相互作用来促进circRNA的反向剪接和环化。
机制总结:本研究描绘了GEM如何增强QKI介导的circRNA剪接和环化的机制,以及circRNA如何招募FOXA1和TET1来调控LIG1转录和DNA损伤修复途径,从而有助于PDAC细胞对GEM诱导的DNA损伤和凋亡产生耐药性。
后序:
免疫沉淀试验(IP、RIP、CHIP、CHIRP)在临床基础医学的机制研究中发挥着关键作用,通过揭示分子间的相互作用,进而阐明详细的分子调控网络,有助于我们更深入地理解疾病的本质和发展过程。该试验对临床基础科研提供宝贵的线索和启示:
1.它能帮助科研人员发现分子间的直接相互作用,这对于揭示细胞信号传导和调控机制至关重要。
2.蛋白质通常以复合物的形式存在并发挥作用,其成分和动态变化往往与疾病的发生和发展密切相关。免疫沉淀技术可以捕获并研究这些蛋白复合物,揭示其在疾病过程中的作用机制。
3.免疫沉淀试验还能结合其他技术,如质谱分析和测序技术等,解析与目标蛋白相互作用的蛋白质网络,有利于我们更全面地了解疾病的分子机制,为疾病的精准治疗提供理论支持。
让科学研究更简单,是我们的理念和追求!
背景:做过临床基础科研的朋友,都要面临一个共同的挑战,机制。
痛点:做过机制研究的朋友,都要面临一个共同的痛点,即信号通路机制易做,但互作机制太难。不做,文章层次上不去;做了,海量的数据反复探索无法上岸。
方案:针对这个痛点,广州基云生物重点推出“互作机制研究系统性解决方案”,包括免疫沉淀试验(IP、RIP、CHIP、CHIRP)和蛋白组芯片检测试验,协助轻松突破互作机制,让科研成果更上一层楼。
推广:十年蛰伏磨一剑,利剑出鞘,成人达己!广州基云生物欢迎终端老师咨询试用,欢迎渠道朋友加盟。我们团队期待与您进行项目沟通、合作、共赢、
官网:https://www.gc-health.com.cn/
正题:
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图1. circ-0007919促癌耐药的科学假说(Ref. Fig.8)。
项目Highlights如下:
临床相关性:circRNA在GEM耐药的PDAC组织和细胞中高表达,且高表达与PDAC患者的总生存期和无病生存期差相关。
下游功能靶点:circRNA 以 LIG1 依赖性方式抑制 GEM 诱导的 DNA 损伤、DNA 断裂积累和细胞凋亡。
互作调控机制:circRNA 招募 FOXA1 和 TET1 增强 LIG1 的转录,促进 DNA 损伤应答。
上游产生机制:GEM增强OKI和内含子结合,促进circRNA环化形成。
临床诊疗意义:靶向circRNA和DNA损伤修复途径可能是PDAC的一种潜在治疗策略。
本文侧重:重点对机制研究进行解读,以飨读者。
(1)如何确定circRNA的下游功能靶点LIG1?
图2. 通过RNAseq发现circRNA的转录调控特征,聚焦下游关键功能靶点LIG1(Ref. Fig.4)。
组学发现:作者通过RNA-seq技术,检测沉默circRNA的PANC-1/GEM耐药株细胞与对照细胞,发现739个差异基因,包括520个上调基因和219个下调基因。这些差异基因在多种DNA损伤修复通路中富集,包括碱基切除修复、错配修复和核苷酸切除修复。在这些通路中,包含显著下调的共同基因LIG1。LIG1是DNA连接酶家族的成员,在几乎所有DNA损伤修复通路中发挥着重要作用。
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回复验证:通过体内和体外实验证实,LIG1能够逆转circRNA对细胞增殖、凋亡和DNA损伤的影响。沉默LIG1会导致细胞增殖减少、凋亡增加和DNA损伤增加,而过表达LIG1则能够逆转由circRNA沉默引起的这些变化。
结论:circRNA通过诱导LIG1的表达来减少DNA损伤、促进细胞增殖和降低凋亡,从而增强细胞对GEM的抵抗性。
(2)circRNA如何调控LIG1转录表达?
图3. 通过CoIP、CHIRP和RIP验证circRNA和FOX1/TET1互作的分子机制(Ref. Fig.6)。
数据库分析筛选:通过FISH和核-细胞质RNA分离实验发现,circRNA主要分布在细胞核中。利用数据库分析发现,circRNA与LIG1启动子的结合蛋白有显著重叠,其中FOXA1是最显著的蛋白。进一步预测与FOXA1共同作用的蛋白,发现TET1与FOXA1结合。
调控互作复合体验证:在GEM耐药株中,CoIP验证FOXA1和TET1相互作用;进一步沉默FOXA1和TET1后,LIG1表达降低,证实在耐药株中FOXA1/TET1复合体协同调控LIG1表达。进一步通过ChIRP和RIP实验证实circRNA能够与FOXA1和TET1蛋白结合。
图4. 通过ChIP和双荧光素酶试验验证circRNA影响FOX1/TET1结合LIG1启动子(Ref. Fig.7)。
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结论:circRNA通过结合FOXA1和TET1增强了LIG1的转录。
(3)circRNA的上调表达是如何被调控的?
图4. 通过RIP验证OKI和内含子结合强度在不同细胞中的差异(Ref. Fig.8)。
调控蛋白检测:circRNA是由其母基因ABR外显子3-16的外显子通过反向剪接生成的。与正常的PDAC组织和细胞相比,GEM耐药的PDAC组织和细胞中circRNA的表达上调。文献表调研明,QKI、FUS和ADAR1多种蛋白质参与circRNA合成过程中的反向剪接。作者研究这些蛋白与GEM耐药PDAC组织中circRNA表达之间的相关性,发现QKI与circRNA的表达呈正相关。进一步在GEM耐药的PDAC细胞中沉默了QKI,发现circRNA的表达下调,但目基因ABR的表达不受影响。这些表明:QKI可能参与促进circRNA的形成。
调控蛋白验证:在正常PDAC细胞和GEM耐药细胞之间,QKI的表达没有差异,但RIP实验结果发现QKI可以与PDAC细胞中的环化内含子结合,且在GEM耐药PDAC细胞中的相互作用显著增强。
结论:GEM通过增强QKI与circRNA两侧内含子之间的相互作用来促进circRNA的反向剪接和环化。
机制总结:本研究描绘了GEM如何增强QKI介导的circRNA剪接和环化的机制,以及circRNA如何招募FOXA1和TET1来调控LIG1转录和DNA损伤修复途径,从而有助于PDAC细胞对GEM诱导的DNA损伤和凋亡产生耐药性。
后序:
免疫沉淀试验(IP、RIP、CHIP、CHIRP)在临床基础医学的机制研究中发挥着关键作用,通过揭示分子间的相互作用,进而阐明详细的分子调控网络,有助于我们更深入地理解疾病的本质和发展过程。该试验对临床基础科研提供宝贵的线索和启示:
1.它能帮助科研人员发现分子间的直接相互作用,这对于揭示细胞信号传导和调控机制至关重要。
2.蛋白质通常以复合物的形式存在并发挥作用,其成分和动态变化往往与疾病的发生和发展密切相关。免疫沉淀技术可以捕获并研究这些蛋白复合物,揭示其在疾病过程中的作用机制。
3.免疫沉淀试验还能结合其他技术,如质谱分析和测序技术等,解析与目标蛋白相互作用的蛋白质网络,有利于我们更全面地了解疾病的分子机制,为疾病的精准治疗提供理论支持。
让科学研究更简单,是我们的理念和追求!
背景:做过临床基础科研的朋友,都要面临一个共同的挑战,机制。
痛点:做过机制研究的朋友,都要面临一个共同的痛点,即信号通路机制易做,但互作机制太难。不做,文章层次上不去;做了,海量的数据反复探索无法上岸。
方案:针对这个痛点,广州基云生物重点推出“互作机制研究系统性解决方案”,包括免疫沉淀试验(IP、RIP、CHIP、CHIRP)和蛋白组芯片检测试验,协助轻松突破互作机制,让科研成果更上一层楼。
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