你的目标物种是啥啊。这个是gRNA和donor都已经在里面了，就是用来敲细菌里面poxb300的。看他们那篇图3，这不是通用载体吧。

在解决CRISPR质粒构建中N20插入的问题时，需要考虑质粒设计的细节和酶切位点的使用。以下是一些步骤和建议，以帮助你完成这个任务：
分析质粒构建细节
了解质粒图谱：首先，确保你完全了解Dongdong Zhao构建的pRed_Cas9_∆poxB300质粒的详细图谱和各个酶切位点的位置。
单酶切位点的使用：由于你的质粒只有一个BglⅡ酶切位点，需要考虑如何利用这个单一酶切位点来插入N20序列。
插入N20的策略
方法一：双链寡核苷酸插入
设计双链寡核苷酸（Oligos）：设计两条互补的寡核苷酸，使它们在退火后形成一个双链结构，并在两端具有BglⅡ酶切位点的黏性末端。N20序列将包含在这对寡核苷酸的中间。
酶切质粒和寡核苷酸：用BglⅡ酶切质粒，使其产生开放的黏性末端。然后，将设计好的双链寡核苷酸也用BglⅡ酶处理，以确保它们的末端可以与质粒末端互补配对。
连接反应：将处理过的质粒和双链寡核苷酸混合，并使用DNA连接酶进行连接反应，使N20序列插入到质粒的BglⅡ位点。
方法二：使用DNA聚合酶填补单链空隙
线性化质粒：同样，用BglⅡ酶切质粒以线性化。
退火并延伸寡核苷酸：设计一对寡核苷酸，使一条具有BglⅡ黏性末端并包含部分N20序列，另一条为完整N20序列。让它们退火并使用DNA聚合酶延伸，以填补空隙。
连接并转化：将延伸后的产物与质粒连接并转化到细菌中进行扩增。
实验步骤与验证
准备并退火寡核苷酸：
按照设计好的序列合成寡核苷酸，并退火形成双链。
酶切和纯化质粒：
用BglⅡ酶切质粒，进行琼脂糖凝胶电泳后纯化目的片段。
连接反应：
进行连接反应，将双链寡核苷酸插入到质粒中。
转化：
将连接产物转化到感受态细菌中，并筛选阳性克隆。
验证插入：
使用PCR和测序验证N20序列的正确插入。
利用BglⅡ单酶切位点插入N20序列可以通过设计双链寡核苷酸或使用DNA聚合酶填补单链空隙的方法实现。关键在于精确的设计和实验步骤的执行，确保N20序列成功插入质粒，并通过PCR和测序验证构建的正确性。